تلطيخ الجرام هو تقنية سريعة ويستخدم لمعرفة وجود البكتيريا في عينة الأنسجة وتصنيف البكتيريا على أنها موجبة الجرام أو سالبة الجرام ، بناءً على الخصائص الكيميائية والفيزيائية لجدرانها الخلوية. غالبًا ما تستخدم صبغة غرام كخطوة أولى في تشخيص العدوى البكتيرية.
سميت تقنية التلوين هذه على اسم العالم الدنماركي هانز كريستيان غرام (1853-1938) ، الذي طور هذه التقنية في عام 1882 ونشرها في عام 1884 كطريقة للتمييز بين نوعين من البكتيريا ذات الأعراض السريرية المتشابهة: العقدية الرئوية (المعروفة أيضًا باسم Streptococcus pneumoniae). pneumococci) و بكتيريا Klebsiella pneumoniae.
خطوة
طريقة 1 من 3: تحضير شريحة المجهر
الخطوة 1. استعد للعمل في المختبر
ارتدِ قفازات وربطة شعر طويلة لمنع التلوث البكتيري للعينة التي تختبرها. نظف مكان العمل تحت غطاء دخان أو في منطقة أخرى جيدة التهوية. تحقق من موقد بنسن وتأكد من أن المجهر يعمل بشكل صحيح قبل البدء.
الخطوة 2. تعقيم الشريحة الزجاجية المجهر
إذا كانت الشريحة الزجاجية متسخة ، اغسلها بالماء والصابون لإزالة الزيت والأوساخ. نظف الشرائح باستخدام الإيثانول أو منظف الزجاج أو أي طريقة أخرى يستخدمها مختبرك.
الخطوة 3. ضع العينة على الشريحة الزجاجية
يمكنك استخدام تقنية صبغة غرام للمساعدة في تحديد البكتيريا في عينة طبية ، أو ثقافة البكتيريا التي تنمو في طبق بتري. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم صبغة جرام على ضربات رقيقة من العينة. يُنصح باستخدام العينات التي يقل عمرها عن 24 ساعة ، حيث قد تكون البكتيريا القديمة قد أضرت بجدرانها الخلوية وقد لا تستجيب لتلطيخ الجرام.
- إذا كنت تستخدم عينة من الأنسجة ، أضف 1-2 قطرات إلى شريحة زجاجية. انتشر بالتساوي على الشريحة لتشكيل طبقة رقيقة من رش العينة ، عن طريق تحريكها باستخدام حافة الشريحة الزجاجية الأخرى المعقمة. اتركه يجف قبل القيام بالخطوة التالية.
- إذا كنت تتناول البكتيريا من طبق بتري ، فقم بتعقيم حلقة التلقيح في موقد بنسن حتى يتوهج ، ثم اتركها لتبرد. استخدم الحلقة لتقطير الماء المعقم على الشريحة ، ثم قم بتعقيمها وتبريدها مرة أخرى قبل استخدامها لجمع عينة صغيرة من البكتيريا. بعد ذلك حركي برفق.
- يجب تقليب البكتيريا المحضرة في المرق مرة أخرى باستخدام دوامة ، ثم يتم أخذها مع حلقة التلقيح على النحو الوارد أعلاه ، دون إضافة الماء.
- إذا كان لديك عينة مسحة (عادة ما يتم إجراؤها بمقبض صغير ذي رأس قطني) ، فالمس المسحة وقم بتدويرها برفق فوق الشريحة.
الخطوة 4. ارتفاع طفيف في درجة الحرارة يمكن أن يصنع لطخة جيدة
ستحتفظ الحرارة بالبكتيريا أعلى الشريحة حتى لا تذوب بسهولة أثناء عملية التلوين. اضغط على الشريحة بسرعة مرتين إلى ثلاث مرات فوق موقد بنسن ، أو قم بتسخين الشريحة فوق سخان منزلق كهربائي. لا تسخن ، فقد تتلف العينة. إذا كنت تستخدم موقد بنسن ، فيجب أن يكون لهبًا صغيرًا ولكنه أزرق بدلاً من لهب برتقالي كبير.
بدلاً من ذلك ، يمكن أيضًا عمل مسحة بالميثانول ، عن طريق إضافة قطرتين أو قطرتين من الميثانول إلى مسحة جافة ، وتجفيف الميثانول المتبقي على الشريحة عن طريق تركه في الهواء الطلق. تقلل هذه التقنية من تلف الخلايا وتوفر خلفية صورة شريحة نظيفة
الخطوة 5. ضع الشريحة فوق علبة التلوين
صواني التلوين مصنوعة من ألواح معدنية أو زجاجية أو بلاستيكية ضحلة بشبكة ناعمة تبطن الجزء العلوي. ضع الشرائح فوق هذه الشباك ، بحيث يمكن تصريف السائل الذي تستخدمه في الدرج.
إذا لم يكن لديك صينية تلوين ، يمكنك وضع شريحة على صينية بلاستيكية لطباعة مكعبات الثلج
الطريقة 2 من 3: عملية صبغ الجرام
الخطوة 1. صب السائل البنفسجي البلوري فوق اللطاخة
استخدم ماصة لرش عينة من البكتيريا ببضع قطرات من صبغة الكريستال البنفسجي ، المعروفة أيضًا باسم الجنطيانا البنفسجي. اتركه لمدة 30-60 ثانية. ينفصل الكريستال البنفسجي (KV) في محلول مائي إلى KV + وأيونات الكلوريد (Cl-). تخترق هذه الأيونات جدران الخلايا وأغشية الخلايا لكل من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام. يتفاعل أيون KV + مع المكونات سالبة الشحنة للخلايا البكتيرية ، مما يعطي الخلايا لونًا أرجوانيًا.
تستخدم العديد من المعامل الكريستال البنفسجي "Hucker" الذي يحتوي على أكسالات الأمونيوم لمنع الترسب
الخطوة 2. اشطف البنفسج الكريستالي برفق
قم بإمالة الشريحة واستخدم زجاجة الغسالة لرش تيار صغير من الماء المقطر أو ماء الصنبور فوق الشريحة. يجب أن يتدفق الماء على سطح اللطاخة ، ولا يجب رشه مباشرة على اللطاخة. لا تشطف بشكل مفرط. لإزالة البقع الموجودة في البكتيريا موجبة الجرام.
الخطوة 3. اغسل اللطاخة باليود ، ثم اشطفها
استخدم قطارة لغسل المسحة باليود. اتركه لمدة 60 ثانية على الأقل ، ثم اشطفه بعناية بنفس الطريقة الموضحة أعلاه. يتفاعل اليود ، على شكل أيون سالب الشحنة ، مع KV + لتشكيل مركب مركب كبير بين البنفسجي الكريستالي واليود (مركب مركب CV-I) في الطبقات الداخلية والخارجية للخلية. سيحتفظ هذا المركب من المركبات باللون البنفسجي للبنفسجي الكريستالي داخل الخلية ، في المواقع الملطخة.
اليود مادة أكالة. تجنب الاستنشاق أو الابتلاع أو ملامسة الجلد
الخطوة الرابعة: أضيفي مبيض اللون ، ثم اشطفيه بسرعة
عادة ما يتم استخدام خليط 1: 1 من الأسيتون والإيثانول لهذه الخطوة المهمة ، والتي يجب أن يتم توقيتها بعناية. ضع الشريحة بزاوية معينة ، ثم أضف لونًا مبيضًا حتى يختفي اللون الأرجواني في الماء المستخدم للشطف. يستغرق هذا عادةً أقل من 10 ثوانٍ ، أو حتى وقتًا أقل إذا كان المُبيض يحتوي على تركيز عالٍ من الأسيتون. أوقف هذه الخطوة على الفور ، وإلا فإن الصبغة سوف تتسرب أيضًا من اللون البنفسجي البلوري من الخلايا الموجبة والسالبة للجرام ، ويجب تكرار عملية التلوين. اشطفي فورًا أي كمية زائدة من مبيض الألوان باستخدام التقنية السابقة.
- يمكن استخدام الأسيتون النقي (95٪ +) كبديل ، فكلما زاد استخدام الأسيتون ، زادت سرعة المبيض ، لذا عليك الانتباه أكثر إلى التوقيت.
- إذا كنت تواجه مشكلة في تتبع الوقت لهذه الخطوة ، فأضف مبيض الألوان قطرة تلو الأخرى.
الخطوة 5. رش الصبغة المضادة على اللطاخة ، ثم اشطفها
تستخدم صبغة مضادة ، عادة سافرانين أو فوشسين ، لزيادة التباين بين البكتيريا سالبة الجرام والبكتيريا موجبة الجرام ، عن طريق تلطيخ البكتيريا (المزيلة اللون) ، أي البكتيريا سالبة الجرام ، الوردي أو الأحمر. اتركها لمدة 45 ثانية على الأقل ، ثم يشطف.
سوف يلطخ Fuchsin بشكل مكثف العديد من البكتيريا سالبة الجرام ، مثل Haemophilus spp و Legionella spp. هذه الطريقة جيدة للمبتدئين
الخطوة 6. جفف الشريحة
يمكنك تجفيفها في الهواء الطلق لتجفيفها ، أو تجفيفها باستخدام ورق مائي تم بيعه لهذا الغرض. اكتملت عملية صبغ غرام.
طريقة 3 من 3: التحقق من نتائج التلوين
الخطوة 1. تحضير المجهر الضوئي
ضع الشريحة تحت المجهر. تتنوع البكتيريا بشكل كبير في الحجم ، لذا فإن التكبير الكلي المطلوب سيختلف من 400x إلى 1000x. يوصى باستخدام عدسة موضوعية مع زيت غاطس للحصول على صورة أكثر وضوحًا. قم بإسقاط زيت الغمر على الشريحة ، مع تجنب الحركة أثناء التنقيط لمنع تكون الفقاعات.حرك مقبض عدسة المجهر بحيث تستقر العدسة الشيئية في مكانها وتلامس الزيت.
لا يمكن استخدام الغمر بالزيت إلا على العدسات المصممة خصيصًا ، وليس على العدسات "الجافة"
الخطوة الثانية: حاول تحديد البكتيريا موجبة الجرام والبكتيريا سالبة الجرام
افحص الشريحة تحت المجهر الضوئي. تظهر البكتيريا موجبة الجرام أرجوانية اللون ، لأن البنفسجي البلوري محاصر داخل جدار الخلية السميك. تكون البكتيريا سالبة الجرام وردية أو حمراء اللون ، لأن اللون البنفسجي البلوري يتم شطفه من خلال جدران الخلايا الرقيقة ، حيث تدخل الصبغة الوردية المضادة.
- إذا كانت العينة سميكة جدًا ، فقد تكون النتيجة إيجابية خاطئة. قم بصبغ عينة جديدة إذا أظهرت كل البكتيريا موجبة الجرام ، للتأكد من أن النتيجة صحيحة.
- إذا كنت تستخدم الكثير من مبيض الألوان ، فقد تكون النتيجة سلبية خاطئة. صبغ عينة جديدة إذا ظهرت بكتيريا سالبة الجرام للتأكد من صحة النتيجة.
الخطوة الثالثة. قارن النتائج التي تراها بالصورة المرجعية
إذا كنت لا تعرف شكل البكتيريا ، فقم بدراسة مجموعة الصور المرجعية ، المصنفة عادة حسب الشكل وصبغة غرام. يمكنك أيضًا عرض قواعد البيانات عبر الإنترنت على [National Microbial Pathogen Database ، Bacteria in Photos ، والعديد من المواقع الأخرى على الإنترنت. لتسهيل التعرف ، فيما يلي أمثلة للبكتيريا التي يتم مواجهتها بشكل شائع أو مهمة للتشخيص ، مصنفة وفقًا لحالة الجرام وشكلها.
الخطوة الرابعة: تحديد البكتيريا موجبة الجرام بناءً على شكلها
تصنف البكتيريا أيضًا وفقًا لشكلها تحت المجهر ، وغالبًا ما يتم تصنيفها على أنها كروية (كروية) أو قضبان (أسطوانية). فيما يلي بعض الأمثلة على البكتيريا موجبة الجرام (اللون الأرجواني) وفقًا لشكلها:
- موجبة الجرام الكوتشي عادة ما تكون المكورات العنقودية (التي تعني مجموعة cocci) أو العقديات (التي تعني سلسلة cocci).
- قضبان موجبة الجرام مثل Bacillus و Clostridium و Corynebacterium و Listeria. بكتيريا العصا الشعيات النيابة. عادة ما يكون لها فروع أو خيوط.
الخطوة 5. تحديد البكتيريا سالبة الجرام
غالبًا ما يتم تصنيف البكتيريا سالبة الجرام (ذات اللون الوردي) إلى ثلاث مجموعات. الكوتشي كروية الشكل ، والقضبان طويلة ورفيعة ، فيما بينهما قضبان كروية.
- غرام مكوت سالب الأكثر شيوعًا هو Neisseria spp.
- قضبان سالبة الجرام مثل E. coli و Enterobacter و Klebsiella و Citrobacter و Serratia و Proteus و Salmonella و Shigella و Pseudomonas وغيرها الكثير. يمكن رؤية ضمة الكوليرا على أنها جذع عادي أو ساق منحني.
- البكتيريا العصوية "العصوية" سالبة الجرام على سبيل المثال البورديتيلا والبروسيلا والمستدمية والباستوريلا
الخطوة 6. تحقق بعناية إذا كانت النتائج مختلطة
يصعب تلوين بعض البكتيريا بدقة ، بسبب هشاشة جدرانها الخلوية أو طبيعتها الشمعية. قد تظهر هذه البكتيريا مزيجًا من اللون الأرجواني أو الوردي في نفس الخلية ، أو بين خلايا مختلفة في نفس اللطاخة. يمكن للعينات البكتيرية التي يزيد عمرها عن 24 ساعة أن تظهر هذه المشكلة ، ولكن هناك أيضًا بعض الأنواع البكتيرية التي لا يزال من الصعب تلوينها في أي عمر لأخذ العينات. تتطلب هذه البكتيريا اختبارات أكثر تخصصًا لتحديدها ، مثل التلوين السريع الحمضي ، أو الملاحظة في الثقافة البكتيرية ، أو وسائط TSI المزروعة ، أو الاختبارات الجينية.
- الشعيات ، المفصليات ، الوتدية ، المتفطرة ، و Propionibacterium spp. كلها بكتيريا موجبة الجرام ، لكنها غالبًا لا تكون ملطخة بشكل واضح.
- البكتيريا الصغيرة النحيلة مثل اللولبيات والكلاميديا والريكتسيا. من الصعب تلطيخ طريقة الجرام.
الخطوة 7. تخلص من أي مواد استهلاكية متبقية ومعدات
يختلف إجراء التخلص من النفايات هذا بين المختبرات ويعتمد على المواد المستخدمة. عادة ، يتم التخلص من السائل الموجود في صينية التلوين في زجاجات مصنفة على أنها نفايات خطرة. انقع الشرائح في محلول مبيض بنسبة 10٪ ، ثم تخلص منها في وعاء الأدوات الحادة.
نصائح
- تذكر أن نتائج صبغة جرام ستكون جيدة فقط إذا كانت العينة جيدة. من المهم إبلاغ المرضى حتى يتمكنوا من تقديم عينة جيدة (على سبيل المثال ، الفرق بين البصق مقابل السعال العميق للحصول على عينة من البلغم).
- كمبيض لوني ، يتفاعل الإيثانول بشكل أبطأ من الأسيتون.
- الالتزام بلوائح المختبر القياسية لضمان السلامة.
- استخدم مسحة الخد للتدرب لأنها تحتوي على بكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام. إذا رأيت نوعًا واحدًا فقط من البكتيريا ، فربما تستخدم كمية قليلة جدًا أو كثيرة جدًا من المُبيض.
- يمكنك استخدام المشابك الخشبية لتأمين الشريحة.
تحذير
- الأسيتون والإيثانول مواد قابلة للاشتعال. سيزيل الأسيتون الزيت من يديك ، مما يسهل على بشرتك امتصاص المواد الكيميائية الأخرى. ارتدِ القفازات واستخدمها بحذر.
- لا تدع المسحة تجف قبل شطف بقعة غرام أو البقع المضادة.
ماذا تحتاج
- عينة الشبكة
- شريحة زجاجية
- ماصة
- مصدر حريق صغير ، أو سخان منزلق ، أو ميثانول
- ماء
- الكريستال البنفسجي
- اليود
- مبيض الألوان ، مثل الكحول أو الأسيتون
- سفرانين
